中成药连花清瘟正在治疗新冠肺炎中发挥积极作用。据河北新闻网2月1日消息，以岭药业独家生产的连花清瘟胶囊(颗粒)被《黑龙江省新型冠状病毒肺炎中医药防治方案(2021版)》列为轻型、普通型患者临床治疗期的推荐中成药。
截至目前，连花清瘟已被列入国家卫健委发布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第四至八版)》。
今年1月发表的最新药理研究发现，在人体测得的连花清瘟组分中，大黄酸、连翘苷A、连翘苷I、新绿原酸及其异构体可能发挥抑制新冠病毒的潜在作用。
该研究作者为厦门大学药学院吴彩胜副教授、海军军医大学柴逸峰教授团队等，研究成果《基于人体暴露和ACE2生物色谱筛选中药连花清瘟胶囊的抗COVID -19药理活性成分》在药学顶级期刊《药学学报》发表。
研究团队表示，这是关于连花清瘟人体体内成分的首次全面研究报告。
探索人体体内的连花清瘟活性成分
中医学是从上千年的临床实践中发展起来的学科，中药研究从临床研究入手，在安全剂量下直接开展人体暴露研究，将能够更直观地反映中药的实际作用物质基础。
基于此，厦门大学药学院吴彩胜副教授联合海军军医大学药学院柴逸峰教授、陈啸飞副教授团队、美国Mass Defect Technologies公司朱明社博士，以高分辨质谱数据处理技术和全二维共价固定化生物色谱分析系统为手段，从人体视角探究连花清瘟胶囊抗COVID-19的药理活性成分及其作用机制。该文作为封面文章发表在《药学学报》英文刊(Acta Pharmaceutica Sinica B)2021年第1期上，论文题目为《基于人体暴露和ACE2生物色谱筛选中药连花清瘟胶囊的抗COVID-19药理活性成分》(《Identifying potential anti-COVID-19 pharmacological components of traditional Chinese medicine Lianhuaqingwen capsule based on human exposure and ACE2 biochromatography screening》)。
论文截图
吴彩胜副教授，朱明社博士，柴逸峰教授为文章的共同通讯作者；海军军医大学药学院陈啸飞副教授，厦门大学药学院吴云龙教授，上海交通大学附属上海第九人民医院陈春博士为文章的并列第一作者。该研究工作得到国家自然科学基金、浙江大学新冠应急专项、“重大新药创制”科技重大专项、上海市青年科技启明星等基金的支持。
论文显示，该研究设计了一项单中心、随机、开放、多剂量试验，招募了14名健康受试者。试验采用连续给药(剂量为4.2 g，12粒胶囊)的方法，除第2天外，于第1天到8天给药。此外，第1天和第2天，在给药后取样(血液和尿液)；第3 天到7天，在每次给药前采集血液样本；第8天，在给药前取样(血液和尿液)。
该试验要求受试者在给药前1小时吃早餐，给药前30分钟内饮用240ml温开水，总体试验期为11 天。
同化学药相比，中药研究最大的困难在于，中药是一个复杂的体系，每味中药都相当于成百上千个化学药物的集合。就连花清瘟胶囊而言，其组方由13味中药组成：连翘、金银花、炙麻黄、炒苦杏仁、石膏、板蓝根、绵马贯众、鱼腥草、广藿香、大黄、红景天、薄荷脑、甘草。该研究中，受试者经多次口服给药后，初步鉴定出的人体内的连花清瘟组分共有86个。
那么，哪些成分具有抑制新冠病毒的作用呢？
研究团队通过全二维生物色谱分析系统，筛选出连花清瘟提取物和人尿液样品潜在的ACE2靶向成分。最终，找到了8种高暴露于人体且具有潜在ACE2靶向能力的连花清瘟胶囊成分：新绿原酸及其异构体，苦杏仁苷，野黑樱苷和连翘甙I，芦丁，连翘苷A，甘草甜素和大黄酸。
然而，这种方法只是复杂化学样本的初步筛选，候选活性成分和ACE2之间的相互作用参数还需进一步确认。
8名“种子选手”的三重筛选
确认候选活性成分是否具有ACE2靶向作用至关重要。已有研究表明，筛选具有ACE2靶向能力的药物，有望用于治疗新冠肺炎患者。
该论文介绍，新冠病毒通过其刺突蛋白(S蛋白)与作为人受体的血管紧张素转化酶2(ACE2)结合，从而感染人体。ACE2是一种负调节因子，具有维持肾素-血管紧张素系统(RAS)稳定的能力，对所有器官的生理或病理至关重要。ACE2已被发现广泛分布于心脏、肾脏、睾丸、脂肪组织、脑组织、血管平滑肌细胞，以及胃肠道。
为了确认候选成分与ACE2间的相互关系，针对初步发现的8名“种子选手”，研究团队又进行了三重筛选。
第一重筛选，研究团队对候选成分进行了表面等离子分析(SPR)，以验证其对ACE2重组蛋白的亲和力。这一轮中，苦杏仁苷和野黑樱苷脱颖而出。
平衡解离常数KD值越大意味解离越多，候选成分与 ACE2的亲和力越弱。研究发现，苦杏仁苷(Amygdalin)和野黑樱苷(Prunasin)具有较强的ACE2结合亲和力，KD 值分别为0.221和0.268 μmol/L。野黑樱苷是苦杏仁苷在体内主要的代谢物，在人血清中的暴露量很高。
表1.通过SPR分析获得的靶向ACE2蛋白的候选活性成分的亲和力。 论文附图
甘草甜素(glycyrrhizin)曾被认为是新冠肺炎的有效治疗药物，具有潜在的ACE2结合活性。这项研究确认了甘草甜素的KD值为4.39 μmol/L。
连翘苷A(forsythoside A)和连翘苷I(forsythoside I)是连翘果实中的主要成分，其对ACE2的亲和力被分别测定为15.8 and 18.7 μmol/L。大黄酸(rhein)是另一种在人血清中高暴露的组分，它对ACE2的亲和力适中，KD值为33.3 μmol/L.。
第二重筛选，研究团队进行了ACE2活性抑制试验，通过ACE2抑制剂筛选试剂盒，测试了候选成分对ACE2活性的影响。结果发现，与ACE2结合亲和力较强的两个组分野黑樱苷(prunasin)和甘草甜素(glycyrrhizin)，均未表现出明显的肽酶抑制作用，但是，大黄酸(Rhein)“表现突出”。
试验发现，大黄酸(Rhein)和大黄素-8-O-β-d-葡萄糖苷(emodin 8-O-β-d-glucoside)具有良好的ACE2抑制作用，IC50分别为18.33和22.50μmol/L，(如图1C所示)。值得一提的是，大黄酸(rhein)在人体内暴露程度高，具有良好的活性，这说明其可能是连花清瘟发挥ACE2抑制作用的主要活性成分。
图1.候选成分对ACE2酶活性的抑制作用。
(A)阳性药物MLN-4760
(B)连翘的候选成分
(C)大黄原植物
(D)金银花/烤苦杏仁/甘草根
论文附图
此外，试验结果还显示，三种连翘苷A、B和I，都具有ACE2抑制作用(如图1B所示)，三种绿原酸异构体均表现出中等程度的ACE2抑制活性，IC50都在40μmol / L左右(如图1D所示)。
研究团队认为，连翘苷A和I，新绿原酸及其异构体，都具有良好的体外活性，但体内暴露低，它们可能与大黄素发挥协同作用。这或许反映了中药的协同效应。
第三重筛选，研究团队进行了分子对接实验，以研究6个代表性成分的结合位点。
实验发现，野黑樱苷(prunasin)、连翘苷I(forsythoside I)，甘草甜素(glycyrrhizin)，大黄酸(rhein)，连翘苷A(forsythoside A)和新绿原酸(neochlorogenic acid)这6种具有强亲和力的组分，都能与ACE2和新冠病毒S蛋白结合界面形成恰当的空间互补(如图2A-F所示)。
图2.(A)野黑樱苷、(B)连翘苷I、(C)甘草甜素、(D)大黄酸、(E)连翘苷A、(F)新绿原酸的分子对接结果。 论文附图
图2.(A)野黑樱苷、(B)连翘苷I、(C)甘草甜素、(D)大黄酸、(E)连翘苷A、(F)新绿原酸的分子对接结果。 论文附图
此前，大黄酸显示出了最佳的ACE2抑制作用，分子对接则证明其羧基可与关键的肽酶活性位点Ala387结合，形成氢键。在大黄素-8-O-β-d-葡萄糖苷也观察到了同样的情况。
最终，三层筛选全部命中的4种候选活性成分为，大黄酸，连翘苷A、连翘苷I、新绿原酸及其异构体。
研究团队总结道，这些成分不仅对ACE2表现出良好的亲和力，而且能有效地结合到ACE2与S蛋白复合体的接触面上；通过显著影响新冠病毒S蛋白和人受体ACE2间的结合，其可能发挥抑制新冠病毒的潜在作用，这是防止病毒感染的重要途径。
中西医的碰撞，解密连翘与大黄
早在疫后初期，连花清瘟就被应用于新冠肺炎的临床治疗，入选中药抗疫的“三药三方”，并被列入《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第四至八版)》。
连花清瘟的组方有13味中药，连翘、金银花、炙麻黄、炒苦杏仁、石膏、板蓝根、绵马贯众、鱼腥草、广藿香、大黄、红景天、薄荷脑、甘草。
单就一味连翘来看，连翘苷A和连翘苷I是连翘中的主要成分。上述最新药理研究发现，连翘苷A和连翘苷I都对ACE2蛋白具有良好的亲和力，同时对其有抑制作用，分子对接则证实了它们可以与典型的酶活位点结合。
连花清瘟是一个复方中药，其组方以汉代张仲景《伤寒论》中专治疫病的麻杏石甘汤与清代吴鞠通《温病条辨》中专治疫病的银翘散化裁，汲取明代吴又可《温疫论》治疫证用大黄经验。
从中医理论来讲，大黄通腑泄肺，肺与大肠相表里，让“疫毒”从大便排出，使邪有出路。明代吴又可曾指出，瘟疫治疗宜在人体正气未衰之时，及早攻逐邪气，提前应用通便的大黄，可以截断病情向危重传变。
上述最新药理研究则进一步证实了大黄酸良好的ACE2抑制作用，同时发现大黄酸在人血清中暴露浓度较高。
研究团队表示，本研究证明，基于人体暴露的方法可用于鉴定已证实有疗效的草药产品的药理活性成分。据其所知，这是关于连花清瘟人体体内成分的首次全面研究报告。
此前，已有研究在体外探索了连花清瘟的药理活性。
2020年3月17日，中国工程院院士钟南山团队的研究论文《连花清瘟对新型冠状病毒具有抗病毒、抗炎作用》(《Lianhuaqingwen exerts anti-viral and anti-inflammatory activity against novel coronavirus (SARS-CoV-2)》)，在《药理学研究》(Pharmacological Research)在线刊出，这是中成药有效抗新型冠状病毒SARS-Cov-2的首篇基础性研究文章。
该研究显示，连花清瘟通过抑制病毒复制、引起病毒颗粒形体改变及抑制宿主细胞炎症因子表达，从而发挥抗新冠病毒活性的作用，为连花清瘟联合现有治疗手段治疗COVID-2019的应用提供了依据。
病毒性公共卫生事件中，连花清瘟被多次采用
连花清瘟的研制始于非典。
据环球网此前报道，连花清瘟是2003年非典时期研发治疗流感的创新中药。面对SARS疫情，以岭医药研究院院士专家团队组建针对SARS病毒的中药科研组织，挖掘中医药治“疫”病，制定了连花清瘟处方。
连花清瘟于2004年5月上市，成为我国抗流感药物中的新成员，并且把抑制SARS病毒的作用明确写在了连花清瘟颗粒说明书中。
连花清瘟上市后，广州呼吸疾病国家重点实验室等科研院所研究证实，连花清瘟对甲型H1N1、H3N2、H5N1、H7N9、H9N2，乙型流感病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、手足口病病毒EV71、鼻病毒、疱疹病毒、柯萨奇病毒、MERS等均具有抑制作用。
2009年甲型H1N1流感大流行，相关研究证实，连花清瘟胶囊在抗病毒作用方面与奥司他韦没有差异；在缓解流感症状，特别是退热和缓解咳嗽、头痛、肌肉酸痛和乏力等症状方面，连花清瘟胶囊优于奥司他韦。
及至新冠疫情暴发，连花清瘟再次被采用。
2020年4月12日，国家药品监督管理局批准连花清瘟胶囊/颗粒在原批准适应症的基础上，增加“新型冠状病毒肺炎轻型、普通型”的新适应症。
上市十余年来，从甲型流感、乙型流感、禽流感到新冠肺炎等我国发生的病毒性重大公共卫生事件中，连花清瘟多次被列入《流行性感冒诊断与治疗指南》《人感染甲型H1N1流感诊疗方案》《乙型流感中医药防治方案》《人感染H7N9禽流感诊疗方案》《流行性感冒诊疗方案(2019年版)》《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第四至八版)》等诊疗方案。
据河北新闻网2月1日消息，日前，黑龙江省中医药管理局下发关于印发《黑龙江省新型冠状病毒肺炎中医药防治方案(2021版)》的通知，该《方案》将以岭药业独家生产的连花清瘟胶囊(颗粒)列为轻型、普通型患者临床治疗期的推荐中成药。自新冠肺炎疫情发生以来，连花清瘟胶囊(颗粒)先后被20余省市的新冠肺炎诊疗方案推荐。
近一年的新冠大流行中，连花清瘟也在出海抗疫。
连花清瘟胶囊生产企业以岭药业(石家庄以岭药业股份有限公司)官网1月14日发布公告，近日，公司收到由乌兹别克斯坦卫生部核准签发的药物注册批准文件，批准公司药品连花清瘟胶囊符合乌兹别克斯坦药物标准注册。
该公告显示，截至目前，连花清瘟胶囊已在乌兹别克斯坦、巴西、印度尼西亚、加拿大、莫桑比克、罗马尼亚、泰国等19个国家分别以“中成药”、“药品”、“植物药”、“天然健康产品”、“食品补充剂”、“现代植物药”、“天然药物”等身份注册获得上市许可。
(澎湃新闻记者 李季 实习生王彦琳对此文亦有贡献）
